藍(lán)白斑篩選步驟與原理，藍(lán)白斑實驗失敗的原因

藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的1種方法，是在抗生素篩選基礎(chǔ)上的第2次篩選，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子。在這種方法中，片段被克隆進(jìn)多克隆位點(diǎn)內(nèi)（MCS），而MCS區(qū)位于基因lacΖα內(nèi)部，也就是說成功克隆的載體，其lacΖα基因是破壞了的。本文介紹藍(lán)白斑篩選步驟與原理、及分析實驗失敗原因。

藍(lán)白斑篩選實驗原理

藍(lán)白斑篩選是一種快速有效的重組細(xì)菌鑒定技術(shù)，依賴于β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶是一種在大腸桿菌中出現(xiàn)的酶，將乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。

為了篩選含有重組DNA的克隆，將X-gal生色底物加入到瓊脂板中。如果產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，則X-gal水解形成5-溴-4-氯-吲哚氧基，其自發(fā)二聚化而產(chǎn)生稱為5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛藍(lán)的不溶性藍(lán)色色素。由非重組細(xì)胞形成的菌落因此呈現(xiàn)藍(lán)色，而重組細(xì)胞的菌落呈現(xiàn)白色。從而可以容易地挑選和培養(yǎng)所需的重組菌落。

異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）與X-gal一起用于藍(lán)白斑篩選。IPTG是一種不可代謝的半乳糖類似物，可誘導(dǎo)lacZ基因的表達(dá)。應(yīng)該注意的是，IPTG不是β-半乳糖苷酶的底物，而只是誘導(dǎo)物。為了視覺篩選目的，需要像X-gal那樣的生色底物。